Что такое ПЦР?

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Мюллис, получивший за эту работу Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР широко распространена не только в научно-исследовательских работах, но и является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики, в том числе и инфекционных заболеваний.

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение целевого участка ДНК при помощи термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для легкодоступного анализа. Важно, что происходит амплификация только того участка, который соответствует исследуемой (диагностируемой) последовательности ДНК, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Специфичность и применение

ПЦР, как метод молекулярной диагностики, хорошо зарекомендовал себя, проверен временем и тщательно апробирован. Метод ПЦР, в частности, позволяет определить наличие патогена даже в случае, если в пробе присутствует всего несколько молекул нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) диагностируемого возбудителя болезни. ПЦР позволяет выявлять и точно идентифицировать наличие патогенов, включая конкретные штаммы, не прибегая к трудоёмким и, порой, дорогостоящим микробиологическим методам и растениям-индикаторам, что сегодня особенно актуально. Чувствительность и специфичность метода значительно превосходит таковую у иммунохимических и микробиологических методов, а его ключевые принципы позволяют диагностировать наличие инфекций независимо от антигенной изменчивости патогенов.

Сегодня свой выбор в пользу диагностики методом ПЦР-анализа делают в первую очередь на основе того, что данный подход позволяет обнаруживать наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных инфекциях.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и специально подобранными высокоспецифичными праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 — 30 нуклеотидов. Каждый из подбираемых праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, фланкируя с 3’- и 5’-концов амплифицируемый фрагмент ДНК. В зависимости от того какие участки были выбраны для амплификпции (консервативные или вариабельные), можно идентифицировать патоген, как в пределах определенного вида или семейства, так и с точностью до конкретного штамма. Именно от правильности анализа последовательности нуклеотидов целевой ДНК или РНК и сделанного на его основе подбора праймеров зависит специфичность конкретной тест-системы.

В ходе ПЦР на первом этапе под действием высокой температуры (~94°С) происходит денатурация ДНК — разделение антипаралельных цепей двойной спирали. На втором этапе температуру понижают до уровня, при котором праймеры могут комплементарно взаимодействовать с участками геномной ДНК или кДНК (этап отжига праймеров). Если на этом этапе установить слишком низкую температуру, то праймеры будут отжигаться не только на строго специфичных местах и в результате мы получим множество неспецифических фрагментов разного размера. Если же температуру слишком завысить, то праймеры будут «сваливаться» со своего «родного» сайта связывания, в результате чего мы или вообще не получим продукта, или чувствительность тест-системы будет существенно снижена. Поэтому оптимизация температуры отжига в каждом конкретном случае очень важна. На третьем этапе, следующем после отжига праймеров, устанавливают температуру на уровне 64-72°С (значение конкретной температуры оптимизируется) — этот диапазон температур оптимален для используемых в ПЦР термостабильных ДНК-полимераз. На этом этапе и происходит достройка новой цепи ДНК, начиная с праймера (элонгация цепи). Точно воспроизводящийся программируемый цикл денатурация-отжиг-элонгация обеспечивается в специальных приборах — амплификаторах, повторяется 25-45 раз. Поскольку при каждом цикле количество фрагментов ДНК удваивается, то за 35 циклов от одной молекулы ДНК образуется около 1010, что и определяет высокую чувствительность метода, позволяющего достоверно определять присутствие всего 10-100 молекул целевой ДНК в анализируемом материале.

Принцип флуоресцентной детекции

Классический метод детекции результатов ПЦР — электрофорез в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В ходе электрофореза однородные по размеру ПЦР-фрагменты ДНК движутся в геле под действием электрического поля узкой полосой, размер которой можно определить по специальному ДНК-маркеру. Однако следует иметь ввиду, что этот метод, помимо того, что требует времени и больших трудозатрат, обладает еще одним существенным недостатком — практически неизбежной контаминацией продуктами ПЦР-амплификации лабораторного пространства, следствием которой является получение ложноположительных результатов. Борьба с такой контаминацией очень сложна, требует длительного времени и нет гарантий того, что она не будет повториться снова.

Полностью избежать проблем, связанных с контаминацией позволяет применение методов ПЦР в формате FLASH-ПЦР и/или ПЦР в «реальном времени». В этом случае в реакционную смесь добавляется дополнительный олигонуклеотид (зонд) длиной 25-35 нуклеотидов, комплементарный области ДНК между концами амплифицируемого фрагмента, меченный флуорофором и тушителем флуоресценции. Если ПЦР не идет, зонд остается неповрежденным, и, поскольку тушитель «гасит» флуорофор, разгорания флуоресценции не регистрируется. Если же ПЦР имеет место, т. е. в смеси присутствует целевая ДНК, на которой отжигаются праймеры и зонд между ними, ДНК-полимераза при элонгации цепи, встречая зонд, благодаря своей 5’-3′ экзонуклеазной активности разрушает его, флуорофор отделяется от тушителя и мы регистрируем разгорание флуоресценции, интенсивность которой пропорциональна количеству целевой ДНК в анализируемом образце.

Горячий старт

Как было указано ранее, праймеры могут неспецифично отжигаться на различные, только частично комплементарные им участки ДНК, что происходит и при раскапывании реакционной смеси для ПЦР до постановки пробирок в термоблок амплификатора. Чтобы этого не происходило применяют так называемый «горячий старт». Его осуществление возможно разными способами: физическое разделение смеси, применение модифицированных ферментов. В наших тест-системах используется разделение компонентов реакции слоем парафина. При прогреве смеси до 70°С парафин не дает смешаться компонентам реакции и неспецифического отжига праймеров не происходит.

Внутренний контроль

Внутренний контроль (ВК) позволяет оценить корректность постановки реакции и работоспособность всех компонентов тест-системы. В наших тест-системах используется экзогенный ВК. В реакционную смесь добавляют праймеры и ДНК-матрицу внутреннего контроля в концентрации, не позволяющей амплификации ВК подавлять процесс амплификации фрагментов ДНК диагностируемого патогена.

Размер продуктов амлификации ВК всегда составляет 560 пар нуклеотидов, в то время, как размер продуктов амплификации фрагментов ДНК определяемых патогенов лежит в диапазоне 100-400 пар нуклеотидов. Это обстоятельство позволяет четко различать ампликоны при анализе результатов методом гель-электрофореза. В модификациях ПЦР «в реальном времени» и FLASH-ПЦР детекция сигнала ВК осуществляется в канале HEX, в то время как детекция сигнала амплификации фрагментов ДНК определяемого патогена — в канале FAM.

Независимо от амплификации фрагментов ДНК определяемого патогена всегда должен присутствовать сигнал амплификации ВК. Его отсутствие указывает на то, что либо не были добавлены какие-либо компоненты (в этих случаях сигнал ВК отсутствует во всех пробирках поставленных реакций), либо в выделенной ДНК/РНК присутствуют ингибиторы ПЦР. В последнем случае сигнал ВК присутствует в образце отрицательного контроля, но отсутствует в пробирках с исследуемыми образцами.

Этапы ПЦР-анализа

ПЦР-анализ состоит из следующих этапов.
1. Выделение нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК, далее — НК). На данном этапе растительную ткань гомогенизируют и выделяют тотальную НК (как определяемых патогенов, так и растения-хозяина), очищая ее от других соединений, в том числе являющихся ингибиторами ПЦР. Выделение РНК следует проводить только из свежих тканей. Этап занимает около 1-2 часов (время зависит от количества образцов).

1′ (Только для РНК содержащих вирусов). Проведение реакции обратной транскрипции. Так как вирусы растений в большей части являются РНК-содержащими, необходимо провести реакцию обратной транскрипции для наработки на матрице РНК комплементарной ДНК (кДНК). Для проведения реакции обратной транскрипции можно использовать набор производства ООО «АгроДиагностика». Время проведения этого этапа около 1 часа. Для проверки качества выделения РНК ООО «АгроДиагностика» предлагает использовать тест-систему на мРНК гена актина картофеля. Для постановки реакции обратной транскрипции можно использовать другой набор производства ООО «АгроДиагностика» — Комплект реагентов для проведения обратной транскрипции.

2. Постановка ПЦР и анализ результатов. В ходе этого этапа происходит амплификация специфического участка генома патогена (и/или внутреннего контроля). Гомогенные продукты, накопленные в ходе амплификации, можно детектировать различными способами.

При использовании тест-систем на основе ПЦР «в реальном времени» на этом этапе анализ заканчивается. Длительность всего этапа около 2 часов.

При использовании тест-систем в формате FLASH необходимо перенести пробирки в детектор «Джин» и провести детекцию. Длительность этого этапа не более 10 минут.

В случае использования тест-систем с детекций результатов методом электрофореза необходимо провести электрофоерез в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Визуализацию результатов проводят под УФ транслюминатором на длине волны 312 нм. Длительность этапа около 1 часа.

 схема ПЦР

С более подробной информацией о методе ПЦР, его модификациях, особенностях и др. можно ознакомиться на целом ряде сайтов в интернете, в том числе на сайте https://ru.wikipedia.org/wiki/

Все компоненты, необходимые для ПЦР-диагностики конкретного патогена, присутствуют в соответствующих наборах. Необходимо добавить выделенную из образца тотальную ДНК или, в случае диагностики РНК-содержащих вирусов, кДНК синтезированную на выделенной из анализируемого образца тотальной РНК. Все подробности проведения ПЦР и анализа результатов имеются в прилагаемых к наборам инструкциях.